Praktikum: Analisa Mikrobiologi Untuk Bakteri dan Fungi

loading...
Praktikum: Analisa Mikrobiologi Untuk Bakteri dan Fungi

A. Pendahuluan


Populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Populasi bakteri di laboratorium dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan. Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel.

Prosedur dalam pengambilan sampel tanah jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah,maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisme rhizosfer maka sampel diambil dari sekitarperakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.

Bakteri adalah mikrooganisme prokariot bersel tunggal yang hanya dapat dilihat morfologinya dengan bantuan mikroskop. Berdasarkan penampakan morfologinya, bakteri dikelompokkan ke dalam bentuk : batang (bacillus), koma (vibrio), per (spiral). Ekologinya sangat luas hampir bisa diketemukan di lingkungan manapun termasuk air, tanah, aerob-anaerob, air mendidih, kawah gunung berapi, dasar laut, dan bahkan di dalam tubuh. Bakteri ini telah ada jauh sebelum manusia ada, kurang lebih 3,5 milyar tahun yang lalu.

Fungi adalah jasad eukariot, yang berbentuk benang atau sel tunggal, multiseluler atau uniseluler. Sel-sel fungi tidak berklorofil, dinding sel tersusun dari khitin, dan belum ada diferensiasi jaringan. Fungi bersifat hemoorganoheterotrof karena memperoleh energi dari oksidasi senyawa organik. Fungi memerlukan oksigen untuk hidupnya (bersifat aerobik). Habitat (tempat hidup) fungi terdapat pada air dan tanah. Cara hidupnya bebas atau bersimbiosis, tumbuh sebagai saprofit atau parasit pada tanaman, hewan dan manusia.

1. Isolasi Mikroba


Isolasi mikrobiota yang dilakukan dalam praktikum ini adalah dengan cara pengenceran (dilution), yakni teknik pengenceran bertingkat. Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1:10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

Isolasi Mikroba
Isolasi Mikroba


2. Identifikasi Morfologi Koloni


Mikrobiota dapat tumbuh dengan luar biasa cepat ketika tersuplai dengan nutrisi yang melimpah. Beragam tipe mikrobiota akan menghasilkan tampilan koloni yang beragam pula. Karakteristik koloni yang menggambarkan morfologi suatu koloni mikrobiota dapat berupa bentuk, ukuran, pigmentasi, dll. Hasil identifikasi morfologi koloni dapat digunakan sebagai teknik menentukan jenis dari mikrobiota yang diisolasi. Koloni bakteri dan jamur memiliki beragam karakteristik dan terkadang justru terlihat tidak umum, namun demikian ada beberapa dasar teknik identifikasi yang dapat dilakukan untuk semua jenis koloni, yakni:

  1. Ukuran : dapat berupa pinpoint/punctiform (titik), small (kecil), moderate (sedang), large (besar) dsb.
  2. Bentuk : bentuk koloni yang muncul berupa sirkular, filament dsb.
  3. Elevasi : tampilan elevasi yang terbentuk berupa datar, timbul dsb.
  4. Tepian (Margin) : berupa lekukan, ombak, licin, tak beraturan dsb.
  5. Permukaan : permukaan koloni berupa kerutan (wrinkled), halus, berkontur dsb
  6. Opacity : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni, seperti transparan, buram (opaque), hampir transparan dengan sedikit distorsi (translucent), warna berubah ketika terkena cahaya (iridescent)
  7. Chromogenesis (pigmentasi atau warna permukaan) : pada mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media.

3. Perhitungan Populasi Koloni


Penentuan jumlah bakteri dapat dilakukan melalui penghitungan jumlah bakteri yang hidup (viable count). Penghitungan disebut juga sebagai standard plate count, yang didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel bakteri yang hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media biakan dengan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah bakteri dalam suspensi. Jumlah bakteri merupakan salah satu faktor penting untuk diketahui, karena dapat menentukan kinerja dari bakteri tersebut.

4. Purifikasi


Purifikasi merupakan pemisahan atau pemurnian suatu organisme dari mikroorganisme lain untuk dibiakan. Tujuan purifikasi adalah untuk mendapatkan isolate murni. Apabila dalam pengamatan dari satu koloni terlihat satu bentuk sel yang sama, maka pemurnian telah menghasilkan isolat murni. Setelah dilakukan purifikasi yaitu melakukan identifikasi yang memiliki tujuan untuk membedakan morfologi dari bakteri atau fungi.

5. Pewarnaan Gram (Pewarna Diferensial)


Pewarnaan gram bertujuan untuk menentukan apakah bakteri tersebut termasuk di dalam kelompok bakteri gram positif atau kelompok bakteri gram negatif. Terdapat beberapa faktor yang dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi gram anatara lain pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan, kerapatan sel pada olesan, konsentrasi dan umur pada reagen-reagen yang digunakan untuk pewarna gram, sifat, konsentrasi, dan julah pemucat yang dipakai, dan sejarah biakan.

B. Tujuan Praktikum


Tujuan praktikum acara analisa mikrobiologi untuk bakteri dan fungi adalah:
a. Mahasiswa mampu mengisolasi dan menghitung koloni jamur dan bakteri
b. Mahasiswa mampu melakukan purifikasi jamur dan bakteri

c. Mahasiswa mampu membedakan jamur dan bakteri berdasarkan kenampakan morfologi koloninya
d. Mahasiswa mampu melakukan pengukuran massa pada bakteri dan fungi beserta analisa diferensiasi pada bakteri

C. Alat, Bahan dan, Cara Kerja


1. Alat : lampu Bunsen, timbangan analitik, jarum ose, dryglasky, tabung reaksi, mikropipet, Erlenmeyer, incubator, petridish, hand colony counter, mortar, kaca preparat, bak pewarna, mikroskop, pinset, kertas label, spidol
2. Bahan : sampel tanah rhizosfer, sampel tanah bukan rhizosfer, sampel akar utuh, sampel akar yang dihaluskan, sampel daun utuh, sampel daun yang dihaluskan, alkohol, media NA, media PDA, aquadest, garam fisiologis, seperangkat pewarna gram (ungu kristal, larutan iodium gram, alkohol 95%, safranin)

3. Cara Kerja

a. Bakteri


1) Identifikasi, Perhitungan Koloni, dan Purifikasi


a) Memasukkan 10 gram bahan ke dalam 90 ml garam fisiologis, lalu menggojog hingga homogen (pengenceran 10-1
b) Mengambil 1 ml larutan 10-1, memasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis, lalu menggojog hingga homogen (pengenceran 10-2)
c) Melakukan hal yang sama hingga pengenceran 10-5
d) Mengisolasi mikroba ke dalam media NA dengan cara mengambil 10-1 ml larutan 10-5
e) Menginkubasi isolat-isolat pada suhu kamar, dengan posisi petridish terbalik selama 3 hari kemudian mengamati koloni-koloni dari mikroba yang terbentuk dan menuangkan ke dalam media NA lalu meratakan
larutan tersebut ke seluruh media mengunakan dryglasky steril
f) Mengambil 1 koloni untuk ditumbuhkan lagi ke media agar miring dengan metode zig-zag
g) Menumbuhkan satu koloni bakteri dalam petridish dengan meode goresan kuadran (Streak quadran)
h) Melakukan isolasi mikroba dari bahan sampel lainnya

2) Pewarnaan Gram


a) Melakukan konfirmasi (penyesuaian) antara mikroba yang tumbuh pada isolasi yang pertama dengan yang terakhir
b) Menyiapkan olesan bakteri pada kaca preparat dan memfiksasi dengan panas
c) Meletakkan kaca preparat di atas rak kawat pada bak pewarna
d) Menggenangi olesan bakteri dengan pewarna primer (ungu Kristal) selama 1 menit
e) Memirinkan kaca praparat menggunakan pinset dan membuang kelebihan ungu Kristal dan membilas menggunakan aquades
f) Meniriskan kaca praparat dan meletakkan di atas kawa pada bak pewarna
g) Menggenangi olesan dengan penucat warna waitu alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik hingga zat warna ungu Kristal tidak terlihat
h) Mencuci dengan aquades kemudian meniriskan dan mengembalikan di atas rak kawat pada bak pewarna
i) Menggenangi olesan dengan pewarna tandingan yaitu safranin selama 30 detik dan memiringkan kaca praparat untuk membuang kelebihan safranin kemudian membilas dengan aquades
j) Meniriskan kaca praparat dan menyerap kelebihan air menggunakan kartas serap kemudian mengamati dengan mikroskop

b. Fungi


1) Memasukkan 10 gram bahan ke dalam 90 ml garam fisiologis, lalu menggojog hingga homogen (pengenceran 10-1)
2) Mengambil 1 ml larutan 10-1, memasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis, lalu mengocok hingga homogen (pengenceran 10-2)
3) Melakukan hal yang sama hingga pengenceran 10-5
4) Mengisolasi mikroba ke dalam media PDA dengan cara mengambil 10-1 ml larutan 10-5 dan menuangkan ke dalam media PDA lalu meratakan larutan
5) Menginkubasi isolate-isolat pada suhu kamar, dengan posisi petridish terbalik selama 3 hari kemudian mengamati koloni-koloni dari mikroba yang terbentuk tersebut ke seluruh media mengunakan dryglasky steril
6) Mengambil 1 koloni untuk ditumbuhkan lagi ke media agar miring dengan metode zig-zag
7) Menumbuhkan satu koloni jamur dalam petridish dengan meode goresan kuadran (Streak quadran)
8) Melakukan identifikasi koloni mikroba yang tumbuh
9) Melakukan konfirmasi (penyesuaian) antara mikroba yng tumbuh pada isolasi yang pertama dengan yang terakhir
10) Melakukan isolasi mikroba dari bahan sampel lainnya

Lampiran :


Panduan identifikasi mikrobiologi :

  • Koloni bakteri digambar dengan perbesaran 40x. Dengan perbesaran ini akan tampak bentuk yang jelas dari ukuran koloni yang kecil tetapi sebelumnya digambar dengan mata telanjang terlebih dahulu. Perbesaran ini dapat dicapai baik dengan mikroskop cahaya atau sterio. 
  • Untuk praktisnya koloni digambar dari bagian bawah cawan. Hal ini dilakukan supaya pengkonfirmasian bentuk koloni dapat dikerjakan dengan mudah tanpa harus membuka tutup cawan lagipula kerap kali ditemukan banyak embun di tutup cawan. Penggambaran dengan membuka tutup cawan tidak disarankan.
  • Penentuan letak diameter koloni diputuskan dari koloni tunggal yang tumbuh sendirian, maksudnya tidak tumbuh berdesak-desakan. Ini dipengaruhi kompetisi penyerapan nutient dari agar di bawahnya.
  • Margin koloni ditentukan dari pola tepian koloni tunggal (dari hasil menggambar) bukan dari kumpulan koloni yang memanjang (dari garis streak pertama).
  • Elevasi dan sifat permukaan koloni dapat diketahui dengan memantulkan cahaya lampu ke cawan. Namun perlu diperhatikan bahwa tidak semua jenis bakteri memiliki koloni yang sama dengan media yang berbeda.
Bentuk-bentuk Koloni
Bentuk-bentuk Koloni