Teknik Pewarnaan dan Pengamatan Mikroorganisme

loading...

Teknik Pewarnaan dan Pengamatan Mikroorganisme


Tidak semua mikroorganisme mempunyai zat warna. Mikroorganisme yang tidak berwarna dapat ditembus cahaya, sehingga sukar diamati. Oleh karena itu diperlukan pewarnaan.

Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Teknik pewarnaan bakteri, dapat dibedakan menjadi :
1. Pewarnaan Sederhana (1 zat warna)untuk melihat bentuk dan susunan sel
2. Pewarnaan Diferensial (lebih dari 1 zat warna) untuk melihat bentuk, susunan dan sifat sel. Beberapa contoh pewarnaan diferensial :
(a) Pewarnaan Gram => dinding sel
(b) Pewarnaan Tahan Asam => dinding sel
(c) Pewarnaan untuk melihat Struktur flagel, kapsul, spora, Inti

PEWARNAAN SEDERHANA


Berdasarkan asam-basa dari zat warna
Asam (-) : Eosin, Nigrosin, Merah Kongo
Basa (+) : Met. Biru, Safranin, Kristal Violet
pH ~ 7 => Sel Bakteri (-)

SIFAT ZAT WARNA :


1. PEWARNAAN ASAM (pewarnaan negatif / tidak langsung) : Sel tidak terwarnai, latar belakang terwarnai
2. PEWARNAAN BASA (pewarnaan langsung) : sel terwarnai

PEWARNAAN GRAM


Prinsip : Kemampuan dinding sel mengikat zat warna karena perbedaan sifat kimia dan fisika dinding sel
Empat tahapan perwarnaan gram :
1. Pemberiaan pewarna dasar kristal violet, semua sel ungu
2. Pemberian pewarna penguat (mordan) lugol/iodine, terbentuk kompleks cv-i, sel ungu tua
3. Pencuci warna dasar : alkohol 96 %

gram + : lipid << + alkohol 96% ------->
pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup
kompleks cv-i tidak tercuci
Gram - : lipid >> + alkohol 96% ------->
pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup
kompleks cv-i tercuci
4. Pewarna pembanding : menggantikan warna dasar, safranin
gram - : terwarna (merah)
gram +: tidak terwarna

Bakteri gram-positif antraks (batang ungu) pada contoh cairan serebrospina. Jika ada, bakteri spesies gram-negatif akan berwarna merah muda. (Sel-sel lain adalah sel darah putih (Wikipedia.org)

Dinding sel bakteri gram positif: Dinding sel bakteri gram positif terdiri 40 lapis rangka dasar murein, meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik.

Dinding sel bakteri gram negatif: Dinding sel bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain. Senyawa-senyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak terdapat dalam dinding sel ini.

Pewarnaan tahan asam


Mewarnai genus mycobacterium, spesies spesies tertentu dari genus nocardia
Prinsip : zat lipoid dinding sel bakteri-bakteri di atas tebal , sulit ditembus zat warna, tetapi sudah terwarnai sulit dicuci dengan etanol

Tahapan :
1. Warna dasar : karbol fuchsin + pemanasan
2. Pencucian : alkohol asam ( 3% hcl dalam 95% etanol)
3. Pembanding : metilen biru
hasil : Mycobacterium dan Nocardia berwarna merah, bakteri lain biru

Pewarnaan flagel : - tidak difiksasi panas
- flagel mordant, karbol fuchsin
- flagel merah

Pewarnaan spora : - zat warna dasar malakit hijau
- pembanding safranin
- endospora berwarna hijau, sel vegetatif berwarna merah

Pewarnaan kapsul : - tidak difiksasi panas
- pewarna dasar :kristal violet
- pencuci, pembanding :CuSO4
- sel berwarna violet , kapsul berwarna biru muda.

Pengamatan mikroorganisme


Jarak lensa-objek : 10 x 10 5,00 mm
40 x 10 0,46 mm
100 x 10 0,13 mm

Pada pengamatan bakteri, jarak lensa-objek sangat dekat, udara n=1,0 tidak dapat membiaskan cahaya masuk ke lensa. Akibatnya objek tidak dapat terlihat dengan sempurna atau sama sekali tidak terlihat . Supaya cahaya dapat dibiaskan ke lensa, perlu media yang indeks biasnya sama dengan objek gelas (n = 1,52), yaitu minyak imersi (n = 1,52)