Penetapan Kadar Protein dan Analisis Asam Amino

Posted on
Loading...

A. PENETAPAN KADAR PROTEIN

Dalam analisis protein yang terkandung dalam bahan pangan, umumnya perhatian lebih ditujukan pada kadar total protein daripada terhadap adanya protein spesifik dalam bahan pangan tersebut. Jumlah gram protein dalam bahan pangan biasanya dihitung sebagai hasil perkalian jumlah gram nitrogen dengan faktor 6,25. Seperti telah diutarakan pada Kegiatan Belajar 1, konstanta tersebut diperoleh dari asumsi bahwa protein mengandung 16% nitrogen, dan angka 6,25 adalah hasil pembagian 100 dengan 16.

Sesungguhnya asumsi ini tidak benar karena tidak semua protein mengandung secara tepat 16% nitrogen. Oleh karena itu, kadar protein yang dihitung harus dilaporkan sebagai kadar protein kasar (crude protein).

Nitrogen yang terdapat dalam bahan pangan sesungguhnya bukan hanya berasal dari asam-asam amino protein, melainkan juga dari senyawa-senyawa nitrogen lain yang dapat atau tidak dapat digunakan sebagai sumber nitrogen oleh tubuh. Kadar nitrogen dalam bahan pangan bervariasi antara 150 – 180 g/kg atau sekitar 15 – 18%, tergantung dari jumlah asam-asam amino protein yang dikandungnya, serta senyawa-senyawa nitrogen lain, seperti purin, pirimidin, asam amino bebas, vitamin, kreatin, kreatinin, dan gula-gula amino.

Dalam daging (sapi), satu bagian nitrogen terdapat sebagai asamasam amino bebas dan peptida; daging ikan juga mengandung senyawa-senyawa ini serta basa nitrogen volatil dan senyawa metil-amino. Setengah dari jumlah total nitrogen dalam umbi kentang tidak terdapat sebagai protein; bahkan Air Susu Ibu (ASI) juga mengandung sedikit urea. Kenyataan ini menunjukkan bahwa faktor 6,25 tidak selalu tepat digunakan untuk semua jenis protein. Pada Tabel 1.3 dapat dilihat faktor-faktor konversi yang digunakan untuk menghitung kadar protein beberapa macam bahan pangan.

Faktor yang digunakan untuk konversi kadar nitrogen menjadi kadar protein

Metode yang biasa digunakan untuk menetapkan kadar nitrogen dalam bahan pangan adalah metode Kjeldahl. Beberapa modifikasi telah dilakukan terhadap metode ini untuk meningkatkan ketelitian dan ketepatannya. Prinsip metode ini adalah oksidasi senyawa organik oleh asam sulfat untuk membentuk karbondioksida (CO2) dan air (H2O), serta pelepasan nitrogen dalam bentuk amonia. Amonia yang terdapat dalam asam sulfat berbentuk amonium-sulfat, sedangkan karbondioksida dan air akan terpisahkan oleh proses destilasi. Belerang dioksida adalah produk hasil reduksi dari asam sulfat yang juga bersifat volatil.

Senyawa organik + H2SO4  CO2 + H20 + (NH4)SO4 + SO2

Destruksi sampel untuk membentuk amonium-sulfat merupakan bagian terpenting metode ini. Faktor-faktor yang dianggap paling mempengaruhi adalah jenis katalis yang digunakan dan waktu pemanasan, serta penambahan bahan pereduksi atau pengoksidasi.

Pengukuran amonia setelah terbentuk selama destruksi, dilakukan dengan menggunakan beberapa cara. Dalam salah satu cara, amonia didestilasi setelah penambahan sejumlah alkali (NaOH), kemudian diikat oleh larutan asam (HCl) yang diketahui volume dan konsentrasinya. Setelah itu, asam tersebut dititrasi untuk menentukan berapa banyak amonia yang didestilasi. Dengan cara ini akhirnya dapat dihitung berapa persentase nitrogen yang terkandung dalam bahan; dan selanjutnya kadar protein dihitung dengan cara mengalikan kadar nitrogen tersebut dengan faktor konversi.

Untuk dapat lebih memahami metode penetapan kadar protein, Anda dianjurkan untuk mempelajari prosedur penetapan kadar protein (makro- dan mikro-Kjeldahl) dari AOAC (Association of Official of Analytical Chemists), yang diberikan pada mata ajaran Analisis Pangan.

B. ANALISIS ASAM AMINO

Analisis asam amino ditujukan bukan saja untuk mengetahui jenis asam-asam amino (terutama asam-asam amino esensial) yang terkandung dalam suatu protein bahan pangan (kualitatif), melainkan juga jumlah atau kadarnya (kuantitatif). Data yang diperoleh sangat berguna untuk memprediksi nilai gizi protein tersebut, yaitu melalui perhitungan skor kimia (chemical score) atau PER-hitung (C-PER).

Selain itu, data mengenai komposisi asam-asam amino (esensial) suatu protein bahan pangan sangat berguna untuk meningkatkan nilai gizinya, yaitu dengan cara menambahkan (suplementasi) asam amino esensial yang defisien, atau dengan cara mencampurkan protein tersebut dengan protein lain (komplementasi) sehingga akan diperoleh protein campuran dengan komposisi asam amino esensial yang lebih baik karena kekurangan masingmasing saling tertutupi.

Metode analisis asam amino memerlukan perlakuan pendahuluan terhadap sampel, yaitu untuk menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino bebas. Masalah utama dalam analisis asam amino bahan pangan adalah kemungkinan terjadinya destruksi asam amino selama proses hidrolisis oleh asam. Masalah ini menjadi lebih besar karena destruksi tersebut dapat terjadi justru pada asam-asam amino esensial, yaitu metionin, sistin, lisin, treonin, dan triptofan.

Protein yang terkandung dalam suatu bahan pangan berbeda dalam hal komposisinya dengan bahan pangan lainnya sehingga suatu prosedur hidrolisis yang ideal adalah yang spesifik untuk tiap jenis bahan pangan.

Oleh karena hal ini sulit untuk dilakukan maka diperlukan suatu kompromi antara yang ideal dengan prosedur yang praktis. Asam-asam amino dilepaskan dari molekul protein dan didestruksi dengan kecepatan yang berbeda, tergantung pada komposisi asam amino dan karakteristik sampel protein. Daftar komposisi asam amino sebaiknya diperoleh dari lima hidrolisis yang terpisah, yaitu tiga hidrolisis asam dengan waktu yang berbeda (biasanya 24, 48, dan 72 jam), satu hidrolisis asam setelah dilakukan oksidasi asam performat untuk asam sisteik dan metionin sulfon, serta satu hidrolisis alkali untuk penetapan triptofan.

Tiga waktu hidrolisis asam yang berbeda dimaksudkan untuk dapat memilih waktu yang paling tepat untuk beberapa asam amino, dan untuk membuat ekstrapolasi kepada waktu nol untuk asam-asam amino yang paling labil. Prosedur terpisah untuk asam amino belerang (metionin dan sistin) serta triptofan sebaiknya dilakukan, tetapi umumnya waktu hidrolisis selama 24 jam dapat memberikan data yang cukup baik untuk penetapan skor kimia suatu protein.

Sebagian besar prosedur analisis asam amino menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatrografi kertas telah lama ditinggalkan dan diganti dengan teknik kolom meskipun kromatografi lapis tipis masih sering digunakan.

Penggunaan teknik kromatografi kolom dapat dibagi menjadi dua golongan utama, yaitu prosedur derivatisasi sebelum melewati kolom (precolumn) dan setelah melewati kolom (post-column). Kromatografi pertukaran ion menggunakan teknik derivatisasi post column, di mana asamasam amino dipisah-pisahkan oleh pertukaran ion, kemudian derivatnya dibentuk setelah asam amino tersebut keluar dari kolom sehingga jumlahnya dapat ditentukan. Prosedur derivatisasi yang banyak dipakai adalah menggunakan ninhidrin, diikuti oleh penetapan densitas optik.

Sebaliknya, derivatisasi pre-column, seperti yang digunakan dalam kromatografi gas-cair (gas-liquid chromatography, GLC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC), menggunakan kolom untuk memisahkan derivat asam-asam amino.

Loading...

Selanjutnya derivat tersebut ditentukan jumlahnya dengan menggunakan detektor. Penetapan asam amino dengan menggunakan GLC dan HPLC umumnya lebih cepat dibandingkan dengan kromatografi pertukaran ion, akan tetapi keterbatasannya terletak pada pembuatan derivat-derivat asam-asam amino.

Dalam penggunaan HPLC, sering kali digunakan dansil klorida (5- dimetilamino-1-naftalen sulfonil klorida) untuk derivatisasi asam-asam amino, menghasilkan derivat dansil yang bersifat fluoresen, yang kemudian akan dipisahkan dengan prosedur kromatografi kolom fase dibalik (reversed phase column chromatography). Kolom ini menggunakan gel silika yang akan mengikat grup fungsional hidrokarbon non-polar (contohnya gugus oktadesil) sebagai fase diam (stasioner) dan menggunakan elusi linier berulang (multi-step non-linear elution). Hasil yang diperoleh dideteksi dan diukur dengan suatu detektor fluoresen yang dapat mendeteksi sampai batas piko-gram.

Telah dibuktikan bahwa HPLC dengan menggunakan bermacam-macam fase stasioner non-polar, memberikan hasil yang lebih baik dalam hal pemisahan peptida dibandingkan dengan kromatografi pertukaran ion.

Akan tetapi karena keterbatasannya dalam pemisahan asam-asam amino polar, penggunaannya masih lebih sedikit dibandingkan dengan kromatografi pertukaran ion. Salah satu keunggulan metode HPLC dibandingkan dengan metode-metode lain adalah kemampuannya untuk membedakan asam-asam amino bentuk D- dan bentuk L-.

Analisis asam amino menggunakan kromatografi gas-cair (GLC) memerlukan perubahan asam-asam amino menjadi derivat volatil secara kuantitatif. Derivat volatil tersebut dapat berupa ester asam hidroksi metil, ester trimetil-asil atau N-butil-N-trifluoroasetil. Sebelum diubah menjadi ester volatil, hidrolisat protein harus mengalami pemisahan fraksi asam-asam amino, untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang dapat mempengaruhi analisis. Telah dilaporkan bahwa hasil analisis asam amino menggunakan kromatografi gas-cair tidak jauh berbeda dengan prosedur lainnya.

C. Rangkuman

  1. Dalam analisis protein yang terkandung dalam bahan pangan, umumnya perhatian lebih ditujukan pada kadar total protein daripada terhadap adanya protein spesifik dalam bahan pangan tersebut. Jumlah gram protein dalam bahan pangan biasanya dihitung sebagai hasil perkalian jumlah gram nitrogen dengan faktor 6,25, dan kadar protein yang dihitung dilaporkan sebagai kadar protein kasar (crude protein).
  2. Nitrogen yang terdapat dalam bahan pangan sesungguhnya bukan hanya berasal dari asam-asam amino protein, melainkan juga dari senyawa-senyawa nitrogen lain yang dapat atau tidak dapat digunakan sebagai sumber nitrogen oleh tubuh.
  3. Kadar nitrogen dalam bahan pangan bervariasi antara 150 – 180 g/kg atau sekitar 15 – 18%, tergantung dari jumlah asam-asam amino protein yang dikandungnya, serta senyawa-senyawa nitrogen lain, seperti purin, pirimidin, asam amino bebas, vitamin, kreatin, kreatinin, dan gula-gula amino.
  4. Faktor-faktor konversi yang digunakan untuk menghitung kadar protein beberapa macam bahan pangan adalah sebagai berikut: gandum 5,83; terigu 5,70; makaroni dan spaghetti 5,70; beras 5,95; rye, barley, dan oats 5,83; kacang tanah 5,46; kacang kedelai 5,71; kelapa 5,30; wijen dan biji bunga matahari 5,30; dan susu 6,38.
  5. Metode yang biasa digunakan untuk menetapkan kadar nitrogen dalam bahan pangan adalah metode Kjeldahl. Prinsip metode ini adalah oksidasi senyawa organik oleh asam sulfat untuk membentuk karbon-dioksida (CO2) dan air (H2O), serta pelepasan nitrogen dalam bentuk amonia.
  6. Destruksi sampel untuk membentuk amonium-sulfat merupakan bagian terpenting metode ini. Faktor-faktor yang dianggap paling mempengaruhi adalah jenis katalis yang digunakan dan waktu pemanasan, serta penambahan bahan pereduksi atau pengoksidasi.
  7. Pengukuran amonia setelah terbentuk selama destruksi, dilakukan dengan menggunakan beberapa cara. Dalam salah satu cara, amonia didestilasi setelah penambahan sejumlah alkali (NaOH), yang kemudian diikat oleh larutan asam (HCl) yang diketahui volume dan konsentrasinya. Setelah itu, asam tersebut dititrasi untuk menentukan berapa banyak amonia yang didestilasi.
  8. Analisis asam amino ditujukan bukan saja untuk mengetahui jenis asam-asam amino (kualitatif), melainkan juga jumlah atau kadarnya (kuantitatif). Data yang diperoleh sangat berguna untuk memprediksi nilai gizi protein tersebut dan sangat berguna untuk meningkatkan nilai gizinya.
  9. Metode analisis asam amino memerlukan perlakuan pendahuluan terhadap sampel, yaitu untuk menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino bebas. Masalah utama dalam analisis asam amino bahan pangan adalah kemungkinan terjadinya destruksi asam amino selama proses hidrolisis oleh asam. Masalah ini menjadi lebih besar karena destruksi tersebut dapat terjadi justru pada asam-asam amino esensial, yaitu metionin, sistin, lisin, treonin, dan triptofan.
  10. Idealnya komposisi asam amino suatu protein diperoleh dari lima hidrolisis yang terpisah, yaitu tiga hidrolisis asam dengan waktu yang berbeda (biasanya 24, 48, dan 72 jam), satu hidrolisis asam setelah dilakukan oksidasi asam performat untuk asam sisteik dan metionin sulfon, serta satu hidrolisis alkali untuk penetapan triptofan.
  11. Sebagian besar prosedur analisis asam amino menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatrografi kertas telah lama ditinggalkan dan diganti dengan teknik kolom, meskipun kromatografi lapis tipis masih sering digunakan.
  12. Penggunaan teknik kromatografi kolom dapat dibagi menjadi dua golongan utama, yaitu prosedur derivatisasi sebelum melewati kolom (pre-column) dan setelah melewati kolom (post-column).
  13. Kromatografi pertukaran ion menggunakan teknik derivatisasi post column, di mana asam-asam amino dipisah-pisahkan oleh pertukaran ion, kemudian derivatnya dibentuk setelah asam amino tersebut keluar dari kolom sehingga jumlahnya dapat ditentukan. Prosedur derivatisasi yang banyak dipakai adalah menggunakan ninhidrin, diikuti oleh penetapan densitas optik.
  14. Sebaliknya, derivatisasi pre-column, seperti yang digunakan dalam kromatografi gas-cair (gas-liquid chromatography, GLC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC), menggunakan kolom untuk memisahkan derivat asam-asam amino. Selanjutnya derivat tersebut ditentukan jumlahnya dengan menggunakan detektor.
  15. Dalam penggunaan HPLC, sering kali digunakan dansil klorida (5- dimetilamino-1-naftalen sulfonil klorida) untuk derivatisasi asamasam amino, menghasilkan derivat dansil yang bersifat fluoresen, kemudian akan dipisahkan dengan prosedur kromatografi kolom fase dibalik (reversed phase column chromatography). Hasil yang diperoleh dideteksi dan diukur dengan suatu detektor fluoresen.
  16. Salah satu keunggulan metode HPLC dibandingkan dengan metodemetode lain adalah kemampuannya untuk membedakan asam-asam amino bentuk D- dan bentuk L-.
  17. Analisis asam amino menggunakan kromatografi gas-cair (GLC) memerlukan perubahan asam-asam amino menjadi derivat volatil secara kuantitatif. Derivat volatil tersebut dapat berupa ester asam hidroksi metil, ester trimetil-asil atau N-butil-N-trifluoroasetil.
Loading...